Namen in cilji raziskave
Čebelarstvo ima v Sloveniji dolgoletno tradicijo. Po eni strani lahko govorimo o pomembni kmetijsko-gospodarski panogi, po drugi strani pa ima čebelarstvo edinstveno vlogo pri ohranjanju kulturne dediščine naroda. Glavni namen čebelarstva je še vedno pridobivanje čebeljih pridelkov (med, cvetni prah, propolis, vosek, matični mleček in čebelji strup), ki so nepogrešljivi v prehrani ljudi in imajo dokazano pozitivne učinke na zdravje, uporabljajo pa se tudi v farmacevtski industriji. Čebele imajo izredno pomembno vlogo tudi pri opraševanju kulturnih rastlin ter s tem neprecenljiv gospodarski in naravovarstveni pomen v širšem smislu.
V Sloveniji je dovoljeno čebelariti samo s kranjsko sivko Apis melifera carnica, avtohtono čebeljo pasmo, ki ima značilne ugodne morfološke in etološke lastnosti. Žal so čebelje družine podvržene številnim nalezljivim boleznim, med katerimi sta gospodarsko najpomembnejši predvsem varoza in huda gniloba čebelje zalege. Huda gniloba čebelje zalege (ang. American foulbrood, AFB) je zelo nalezljiva in ena izmed najhujših bolezni čebelje družine, ki se pojavlja predvsem na območjih, v katerih živi medonosna čebela (A. melifera). Povzročitelj bolezni je po Gramu pozitivna, sporogena bakterija Paenibacillus larvae, ki prizadene zelo mlade čebelje ličinke.
Diagnostika bolezni v Sloveniji trenutno temelji na klasični mikrobiološki metodi z izolacijo povzročitelja na gojiščih, ki spodbujajo kalitev spor in rast P. larvae. zadnjem času pa smo ob klasični diagnostiki na osnovi biokemijskih lastnosti, ki je lahko precej zamudna (za P. larvae traja 4–10 dni), tudi v Sloveniji začeli vpeljevati metodo določanja bakterijskih povzročiteljev na osnovi masne spektrometrije z aparaturo MALDI-TOF. Za genotipizacijo pridobljenih izolatov P. larvae je najbolj uveljavljena genotipizacijska metoda ERIC-PCR, ki temelji na pomnoževanju ponavljajočih se ohranjenih genskih zaporedij. Opisani so štirje genotipi P. larvae (ERIC I–IV), v kliničnih primerih pa se pojavljata samo genotipa ERIC I in II.
Vsi izolate P. larvae, pridobljeni v okviru projekta, bodo tipizirani z metodo ERIC-PCR in s tem določili prevalenco tipov ERIC v Sloveniji, ki do danes še ni poznana. Ugotavljala se bo povezava tipov ERIC s pripadajočo klinično sliko in preučena bo smotrnost spremembe smernic za zamejitev bolezni v povezavi s pripadajočim tipom ERIC. Vpeljava metode ERIC bo omogočila tudi ugotavljanje genotipa ERIC pri prospektivnem spremljanju izbruhov hude gnilobe.
V okviru projekta bo vpeljana tudi molekularna kvantifikacija bakterije P. larvae v vzorcih medu z metodo PCR (ang. polymerase chain reaction). Za ta namen bosta uporabiljeni metodi qPCR (PCR v realnem času) in dPCR (digitalni PCR). Glavna prednost metode dPCR je zmožnost absolutne kvantifikacije, ki bo omogočila, da se bo metodo qPCR umerilo glede na rezultate dPCR brez potrebe po štetju bakterij z gojiščno metodo, ki je v primeru spor dokaj nezanesljiva.
Cilji:
- Za izolate P. larvae (vsaj 500) iz let 2017–2019 iz celotne Slovenije sestaviti podatkovno zbirko s pridruženimi epizootiološkimi podatki ter za izolate iz leta 2019 pripraviti tudi anketni vprašalnik za pridobivanje usmerjenih podatkov.
- V bakteriološko diagnostiko vpeljati identifikacijo P. larvae z masno spektrometrijo MALDI‐TOF.
- Izdelati test in vpeljati metodo qPCR za hitro in zanesljivo kvantifikacijo spor P. larvae v vzorcih medu, metodo umeriti z dPCR ter ugotoviti morebitno povezavo med številom spor in kliničnimi znaki HGČZ v čebeljih družinah.
- Vpeljati tipizacijo P. larvae z metodo ERIC‐PCR ter tipizirati večje število izolatov (vsaj 500) iz let
- Vpeljati metodo WGS za tipizacijo P. larvae, ugotoviti poti širjenja klonov P. larvae v Sloveniji ter postaviti genetsko mejo za opredelitev genetsko povezanih (klonalnih) izolatov, ki so udeleženi v izbruhih.
- Posodobiti priporočila za omejitev širjenja HGČZ.
Rezultati:
V okviru projekta so bili analizirani retrospektivno (iz let 2017 in 2018) ter prospektivno (iz leta 2019) pridobljeni izolati Paenibacillus larvae iz izbruhov hude gnilobe čebelje zalege (HGČZ) v Sloveniji; izolati so izvirali iz medu in zalege. Med pomembnejše dosežke projekta sodijo: (i) z anketnim vprašalnikom, ki je bil posredovan čebelarjem in veterinarjem, so bili pridobljeni natančni podatki o čebelarski praksi v Sloveniji; (ii) v diagnostični postopek je bila vpeljana masna spektrometrija MALDI-TOF za identifikacijo izolatov P. larvae, kar je bistveno skrajšalo čas bakterioloških preiskav; (iii) razvit je bil molekularni test qPCR (PCR v realnem času) za zanesljivo štetje spor P. larvae v čebeljih vzorcih, umerjen z digitalnim PCR, s čimer je omogočena absolutna kvantifikacija. Ugotovljeno je bilo, da imajo klinično pozitivne družine značilno več spor kot klinično negativne. Primerjava s števno gojiščno metodo je pokazala slabo (0,52%) in nekonsistentno (0,04–6,05%) kalitev spor P. larvae; (iv) vpeljana je bila metoda ERIC-PCR za tipizacijo sevov, tipizirano je bilo večje število izolatov (n=583), analiza pomnožkov pa je bila izvedena s kapilarno elektroforezo. Ugotovljeno je bilo, da v Sloveniji prevladuje tip ERIC II (70,2%); (v) uporabljena je bila metoda sekvenciranja celotnih genomov (WGS) za identifikacijo in sledenje izbruhom HGČZ. Razvita je bila stabilna shema wgMLST (tipizacija na osnovi zaporedij lokusov celotnega genoma), ki je bila implementirana v programu BioNumerics in omogoča standardizirano bioinformacijsko obdelavo podatkov WGS. Določena je bila mejna vrednost za genetsko povezane (klonalne) izolate P. larvae (≤35 alelov wgMLST), odkrit pa je bil tudi nov sekvenčni tip (ST30). Z obsežnim sekvenciranjem izolatov (n=202) je bilo znatno povečano število genomskih zaporedij v javno dostopnih podatkovnih bazah. Ugotovljeno je bilo, da je velikost kužnega kroga ustrezna pri naravnem prenosu P. larvae med čebeljimi družinami, medtem ko so bili prenosi klonov na večje razdalje posledica prevozov, najverjetneje okuženih čebeljih družin. Ker je bilo potrjenih več takšnih primerov, je bila predlagana uvedba veterinarskih kliničnih pregledov družin pred prevozom.
Ključne besede: huda gniloba čebelje zalege (angl. American foulbrood, AFB), Paenibacillus larvae, poti širjenja, kužni krog, genotipizacija, ERICPCR, sekvenciranje celotnih genomov (angl. whole genome sequencing, WGS)
Kontakt vodilnega partnerja:
- Ime in priimek kontaktne osebe vodilnega partnerja: Darja Kušar
- Institucija: Univerza v Ljubljani, Veterinarska fakulteta
- Naslov institucije: Gerbičeva ulica 60
- E-naslov institucije:
- E-naslov kontaktne osebe vodilnega partnerja:
Projektni partnerji:
/
Povezave:
Povezava na predstavitev projekta na Digitalno knjižnico Slovenije
